novice

V zadnjem desetletju se tehnologija sekvenciranja genov pogosto uporablja v raziskavah raka in klinični praksi ter je postala pomembno orodje za razkrivanje molekularnih značilnosti raka. Napredek v molekularni diagnostiki in ciljno usmerjeni terapiji je spodbudil razvoj konceptov precizne terapije tumorjev in prinesel velike spremembe na celotno področje diagnosticiranja in zdravljenja tumorjev. Genetsko testiranje se lahko uporablja za opozarjanje na tveganje za raka, usmerjanje odločitev o zdravljenju in oceno prognoze ter je pomembno orodje za izboljšanje kliničnih izidov bolnikov. Tukaj povzemamo nedavne članke, objavljene v CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol in drugih revijah, da bi pregledali uporabo genetskega testiranja pri diagnosticiranju in zdravljenju raka.

Somatske mutacije in mutacije zarodne linije. Na splošno raka povzročajo mutacije DNK, ki jih je mogoče podedovati od staršev (mutacije zarodne linije) ali pridobiti s starostjo (somatske mutacije). Mutacije zarodne linije so prisotne od rojstva, mutator pa običajno nosi mutacijo v DNK vsake celice v telesu in se lahko prenese na potomce. Somatske mutacije posamezniki pridobijo v negametnih celicah in se običajno ne prenesejo na potomce. Tako mutacije zarodne linije kot somatske mutacije lahko uničijo normalno funkcionalno aktivnost celic in vodijo do maligne transformacije celic. Somatske mutacije so ključni dejavnik malignosti in najbolj napovedni biomarker v onkologiji; vendar pa približno 10 do 20 odstotkov bolnikov s tumorji nosi mutacije zarodne linije, ki znatno povečajo tveganje za raka, nekatere od teh mutacij pa so tudi terapevtske.
Gonilna mutacija in mutacija potnika. Vse variante DNK ne vplivajo na delovanje celic; v povprečju je potrebnih pet do deset genomskih dogodkov, znanih kot "gonilne mutacije", da se sproži normalna degeneracija celic. Gonilne mutacije se pogosto pojavljajo v genih, ki so tesno povezani z življenjskimi aktivnostmi celic, kot so geni, ki sodelujejo pri regulaciji rasti celic, popravljanju DNK, nadzoru celičnega cikla in drugih življenjskih procesih, in se lahko uporabljajo kot terapevtske tarče. Vendar pa je skupno število mutacij pri katerem koli raku precej veliko, od nekaj tisoč pri nekaterih vrstah raka dojke do več kot 100.000 pri nekaterih zelo variabilnih kolorektalnih in endometrijskih rakih. Večina mutacij nima ali ima omejen biološki pomen, tudi če se mutacija pojavi v kodirajoči regiji, se takšni nepomembni mutacijski dogodki imenujejo "potniške mutacije". Če genska varianta v določeni vrsti tumorja napoveduje njegov odziv na zdravljenje ali odpornost nanj, se varianta šteje za klinično operabilno.
Onkogeni in tumorsupresorski geni. Gene, ki so pogosto mutirani pri raku, lahko v grobem razdelimo v dve kategoriji, onkogene in tumorsupresorske gene. V normalnih celicah ima protein, ki ga kodirajo onkogeni, predvsem vlogo pri spodbujanju celične proliferacije in zaviranju celične apoptoze, medtem ko je protein, ki ga kodirajo onkosupresorski geni, predvsem odgovoren za negativno regulacijo celične delitve za ohranjanje normalne celične funkcije. V procesu maligne transformacije genomska mutacija vodi do povečanja aktivnosti onkogena in zmanjšanja ali izgube aktivnosti onkosupresorskih genov.
Majhne variacije in strukturne variacije. To sta dve glavni vrsti mutacij v genomu. Majhne variacije spreminjajo DNK s spreminjanjem, brisanjem ali dodajanjem majhnega števila baz, vključno z vstavljanjem baz, brisanjem, premikom bralnega okvirja, izgubo začetnega kodona, izgubo stop kodona itd. Strukturne variacije so velike prerazporeditve genoma, ki vključujejo genske segmente velikosti od nekaj tisoč baz do večine kromosoma, vključno s spremembami števila kopij genov, brisanjem kromosomov, podvajanjem, inverzijo ali translokacijo. Te mutacije lahko povzročijo zmanjšanje ali povečanje delovanja beljakovin. Poleg sprememb na ravni posameznih genov so genomski podpisi del poročil o kliničnem sekvenciranju. Genomske podpise lahko vidimo kot kompleksne vzorce majhnih in/ali strukturnih variacij, vključno s tumorsko mutacijsko obremenitvijo (TMB), mikrosatelitsko nestabilnostjo (MSI) in homolognimi rekombinacijskimi napakami.

Klonske mutacije in subklonske mutacije. Klonske mutacije so prisotne v vseh tumorskih celicah, prisotne so ob diagnozi in ostanejo prisotne tudi po napredovanju zdravljenja. Zato se klonske mutacije lahko uporabljajo kot terapevtske tarče za zdravljenje tumorjev. Subklonske mutacije so prisotne le v podskupini rakavih celic in jih je mogoče odkriti na začetku diagnoze, vendar izginejo s poznejšo ponovitvijo ali se pojavijo šele po zdravljenju. Heterogenost raka se nanaša na prisotnost več subklonskih mutacij v enem samem raku. Omeniti velja, da je velika večina klinično pomembnih gonilnih mutacij pri vseh pogostih vrstah raka klonskih mutacij in ostanejo stabilne skozi celotno napredovanje raka. Odpornost, ki jo pogosto posredujejo subkloni, morda ni odkrita ob diagnozi, vendar se pojavi, ko se po zdravljenju ponovi.

Tradicionalna tehnika FISH ali celični kariotip se uporablja za odkrivanje sprememb na kromosomski ravni. FISH se lahko uporablja za odkrivanje genskih fuzij, delecij in amplifikacij ter velja za "zlati standard" za odkrivanje takšnih variant, z visoko natančnostjo in občutljivostjo, vendar z omejeno prepustnostjo. Pri nekaterih hematoloških malignih obolenjih, zlasti akutni levkemiji, se kariotipizacija še vedno uporablja za usmerjanje diagnoze in prognoze, vendar to tehniko postopoma nadomeščajo ciljno usmerjeni molekularni testi, kot so FISH, WGS in NGS.
Spremembe v posameznih genih je mogoče zaznati s PCR, tako s PCR v realnem času kot s PCR z digitalno kapljico. Te tehnike imajo visoko občutljivost, so še posebej primerne za odkrivanje in spremljanje majhnih preostalih lezij in omogočajo pridobitev rezultatov v relativno kratkem času, pomanjkljivost pa je omejen obseg zaznavanja (običajno zaznajo le mutacije v enem ali nekaj genih) in možnost izvajanja več testov.
Imunohistokemija (IHC) je orodje za spremljanje na osnovi beljakovin, ki se pogosto uporablja za odkrivanje izražanja biomarkerjev, kot so ERBB2 (HER2) in estrogenski receptorji. IHC se lahko uporablja tudi za odkrivanje specifičnih mutiranih beljakovin (kot je BRAF V600E) in specifičnih genskih fuzij (kot so fuzije ALK). Prednost IHC je, da jo je mogoče enostavno integrirati v rutinski postopek analize tkiva, zato jo je mogoče kombinirati z drugimi testi. Poleg tega lahko IHC zagotovi informacije o subcelični lokalizaciji beljakovin. Slabosti so omejena skalabilnost in visoke organizacijske zahteve.
Sekvenciranje druge generacije (NGS) NGS uporablja tehnike visokozmogljivega vzporednega sekvenciranja za odkrivanje variacij na ravni DNK in/ali RNK. To tehniko je mogoče uporabiti za sekvenciranje celotnega genoma (WGS) in genskih območij, ki nas zanimajo. WGS zagotavlja najobsežnejše informacije o genomskih mutacijah, vendar obstaja veliko ovir za njegovo klinično uporabo, vključno s potrebo po svežih vzorcih tumorskega tkiva (WGS še ni primeren za analizo vzorcev, imobiliziranih v formalinu) in visokimi stroški.
Ciljno sekvenciranje NGS vključuje sekvenciranje celotnih eksonov in panel ciljnih genov. Ti testi obogatijo zanimiva območja z DNK sondami ali PCR amplifikacijo, s čimer omejijo potrebno količino sekvenciranja (celoten eksom predstavlja 1 do 2 odstotka genoma, celo veliki paneli, ki vsebujejo 500 genov, pa predstavljajo le 0,1 odstotka genoma). Čeprav sekvenciranje celotnih eksonov dobro deluje v tkivih, fiksiranih s formalinom, ostajajo njegovi stroški visoki. Kombinacije ciljnih genov so relativno ekonomične in omogočajo fleksibilnost pri izbiri genov, ki jih je treba testirati. Poleg tega se kot nova možnost za genomsko analizo bolnikov z rakom pojavlja prosta DNK v obtoku (cfDNA), znana kot tekoča biopsija. Tako rakave kot normalne celice lahko sproščajo DNK v krvni obtok, DNK, ki se izloči iz rakavih celic, pa se imenuje krožeča tumorska DNK (ctDNA), ki jo je mogoče analizirati za odkrivanje morebitnih mutacij v tumorskih celicah.
Izbira testa je odvisna od specifičnega kliničnega problema, ki ga je treba obravnavati. Večino biomarkerjev, povezanih z odobrenimi terapijami, je mogoče zaznati s tehnikami FISH, IHC in PCR. Te metode so razumne za zaznavanje majhnih količin biomarkerjev, vendar ne izboljšajo učinkovitosti zaznavanja z naraščajočo prepustnostjo, in če je zaznanih preveč biomarkerjev, morda ni dovolj tkiva za zaznavanje. Pri nekaterih specifičnih vrstah raka, kot je pljučni rak, kjer je vzorce tkiva težko pridobiti in je treba testirati več biomarkerjev, je uporaba NGS boljša izbira. Skratka, izbira testa je odvisna od števila biomarkerjev, ki jih je treba testirati za vsakega bolnika, in števila bolnikov, ki jih je treba testirati na biomarker. V nekaterih primerih zadostuje uporaba IHC/FISH, zlasti ko je tarča identificirana, kot je na primer odkrivanje estrogenskih receptorjev, progesteronskih receptorjev in ERBB2 pri bolnikih z rakom dojke. Če je potrebno bolj celovito raziskovanje genomskih mutacij in iskanje potencialnih terapevtskih tarč, je NGS bolj organiziran in stroškovno učinkovit. Poleg tega se lahko NGS upošteva v primerih, ko so rezultati IHC/FISH dvoumni ali neprepričljivi.

Različne smernice dajejo navodila o tem, kateri bolniki bi morali biti upravičeni do genetskega testiranja. Leta 2020 je delovna skupina ESMO za precizno medicino izdala prva priporočila za testiranje NGS za bolnike z napredovalim rakom, v katerih je priporočila rutinsko testiranje NGS za vzorce napredovalega neploščatoceličnega nedrobnoceličnega pljučnega raka, raka prostate, kolorektalnega raka, raka žolčevoda in raka jajčnikov, leta 2024 pa je ESMO na tej podlagi posodobila smernice in priporočila vključitev raka dojke in redkih tumorjev, kot so gastrointestinalni stromalni tumorji, sarkomi, rak ščitnice in rak neznanega izvora.
Leta 2022 je ASCO v svojem kliničnem mnenju o testiranju somatskega genoma pri bolnikih z metastatskim ali napredovalim rakom navedel, da če je terapija, povezana z biomarkerjem, odobrena pri bolnikih z metastatskimi ali napredovalimi solidnimi tumorji, je za te bolnike priporočljivo genetsko testiranje. Na primer, genomsko testiranje je treba opraviti pri bolnikih z metastatskim melanomom za presejanje mutacij BRAF V600E, saj so za to indikacijo odobreni zaviralci RAF in MEK. Poleg tega je treba genetsko testiranje opraviti tudi, če obstaja jasen marker odpornosti na zdravilo, ki ga je treba dati bolniku. Egfrmab je na primer neučinkovit pri kolorektalnem raku z mutacijo KRAS. Pri presoji primernosti bolnika za sekvenciranje genov je treba upoštevati njegovo fizično stanje, komorbidnosti in stadij tumorja, saj vrsta korakov, potrebnih za sekvenciranje genoma, vključno s soglasjem bolnika, laboratorijsko obdelavo in analizo rezultatov sekvenciranja, zahteva, da ima bolnik ustrezno telesno zmogljivost in pričakovano življenjsko dobo.
Poleg somatskih mutacij je treba nekatere vrste raka testirati tudi na gene zarodne linije. Testiranje mutacij zarodne linije lahko vpliva na odločitve o zdravljenju raka, kot sta mutaciji BRCA1 in BRCA2 pri raku dojke, jajčnikov, prostate in trebušne slinavke. Mutacije zarodne linije lahko vplivajo tudi na prihodnje presejalne preglede in preprečevanje raka pri bolnikih. Bolniki, ki so potencialno primerni za testiranje mutacij zarodne linije, morajo izpolnjevati določene pogoje, ki vključujejo dejavnike, kot so družinska anamneza raka, starost ob diagnozi in vrsta raka. Vendar pa mnogi bolniki (do 50 %), ki nosijo patogene mutacije v zarodni liniji, ne izpolnjujejo tradicionalnih meril za testiranje mutacij zarodne linije na podlagi družinske anamneze. Zato Nacionalna celovita mreža za boj proti raku (NCCN) za čim večjo identifikacijo nosilcev mutacij priporoča, da se vsi ali večina bolnikov z rakom dojke, jajčnikov, endometrija, trebušne slinavke, kolorektuma ali prostate testira na mutacije zarodne linije.
Kar zadeva čas genetskega testiranja, je smiselno, da se genetsko testiranje pri bolnikih izvede ob diagnozi napredovalega raka, saj je velika večina klinično pomembnih mutacij gonilnih dejavnikov klonskih in relativno stabilnih v teku napredovanja raka. Za nadaljnje genetsko testiranje, zlasti po molekularno ciljno usmerjeni terapiji, je testiranje ctDNA ugodnejše od testiranja tumorske tkivne DNK, ker lahko krvna DNK vsebuje DNK iz vseh tumorskih lezij, kar je bolj ugodno za pridobivanje informacij o heterogenosti tumorja.
Analiza ctDNA po zdravljenju lahko napove odziv tumorja na zdravljenje in prepozna napredovanje bolezni prej kot standardne slikovne metode. Vendar pa protokoli za uporabo teh podatkov za usmerjanje odločitev o zdravljenju še niso bili določeni in analiza ctDNA ni priporočljiva, razen v kliničnih preskušanjih. ctDNA se lahko uporabi tudi za oceno majhnih preostalih lezij po radikalni operaciji tumorja. Testiranje ctDNA po operaciji je močan napovedovalec nadaljnjega napredovanja bolezni in lahko pomaga ugotoviti, ali bo bolnik imel koristi od adjuvantne kemoterapije, vendar še vedno ni priporočljivo uporabljati ctDNA zunaj kliničnih preskušanj za usmerjanje odločitev o adjuvantni kemoterapiji.

Obdelava podatkov Prvi korak pri sekvenciranju genoma je ekstrakcija DNK iz vzorcev pacientov, priprava knjižnic in generiranje surovih podatkov sekvenciranja. Surovi podatki zahtevajo nadaljnjo obdelavo, vključno s filtriranjem podatkov nizke kakovosti, njihovo primerjavo z referenčnim genomom, identifikacijo različnih vrst mutacij z različnimi analitičnimi algoritmi, določanjem vpliva teh mutacij na prevajanje beljakovin in filtriranjem mutacij zarodne linije.
Opomba gonilnega gena je zasnovana tako, da razlikuje med mutacijami gonilnega in potniškega gena. Gonilne mutacije vodijo do izgube ali povečanja aktivnosti gena tumor supresorja. Majhne variante, ki vodijo do inaktivacije genov tumor supresorja, vključujejo nesmiselne mutacije, mutacije s premikom bralnega okvirja in mutacije na ključnih mestih spajanja, pa tudi manj pogosto delecijo začetnega kodona, delecijo stop kodona in širok spekter mutacij vstavitve/izbrisa intronov. Poleg tega lahko misenske mutacije in majhne mutacije vstavitve/izbrisa intronov prav tako vodijo do izgube aktivnosti gena tumor supresorja, kadar vplivajo na pomembna funkcionalna področja. Strukturne variante, ki vodijo do izgube aktivnosti gena tumor supresorja, vključujejo delno ali popolno delecijo gena in druge genomske variante, ki vodijo do uničenja bralnega okvira gena. Majhne variante, ki vodijo do povečanega delovanja onkogenov, vključujejo misenske mutacije in občasne vstavitve/izbrise intronov, ki ciljajo na pomembna funkcionalna področja beljakovin. V redkih primerih lahko skrajšanje beljakovin ali mutacije na mestu spajanja vodijo do aktivacije onkogenov. Strukturne variacije, ki vodijo do aktivacije onkogenov, vključujejo fuzijo genov, delecijo genov in podvajanje genov.
Klinična interpretacija genomskih variacij ocenjuje klinični pomen identificiranih mutacij, tj. njihovo potencialno diagnostično, prognostično ali terapevtsko vrednost. Obstaja več sistemov ocenjevanja, ki temeljijo na dokazih in jih je mogoče uporabiti za usmerjanje klinične interpretacije genomskih variacij.
Baza podatkov o precizni onkološki medicini (OncoKB) Centra za raka Memorial Sloan-Kettering razvršča genske variante v štiri ravni glede na njihovo napovedno vrednost za uporabo zdravil: raven 1/2, biomarkerji, ki jih je odobrila FDA, ali klinično standardni biomarkerji, ki napovedujejo odziv specifične indikacije na odobreno zdravilo; raven 3, biomarkerji, ki jih je odobrila ali ni odobrila FDA, ki napovedujejo odziv na nova ciljna zdravila, ki so se v kliničnih preskušanjih pokazala kot obetavna, in raven 4, biomarkerji, ki jih FDA ni odobrila in ki napovedujejo odziv na nova ciljna zdravila, ki so v kliničnih preskušanjih pokazala prepričljive biološke dokaze. Dodana je bila peta podskupina, povezana z odpornostjo na zdravljenje.
Smernice Ameriškega združenja za molekularno patologijo (AMP)/Ameriškega združenja za klinično onkologijo (ASCO)/Kolegija ameriških patologov (CAP) za interpretacijo somatskih variacij delijo somatske variacije v štiri kategorije: stopnja I z močnim kliničnim pomenom; stopnja II s potencialnim kliničnim pomenom; stopnja III z neznanim kliničnim pomenom; stopnja IV, za katero ni znano, ali je klinično pomembna. Za odločitve o zdravljenju so dragocene le variante stopnje I in II.
ESMO-jeva lestvica klinične operabilnosti molekularnih tarč (ESCAT) razvršča genske variante v šest stopenj: stopnja I, tarče, primerne za rutinsko uporabo; faza II, tarča, ki se še preučuje, se bo verjetno uporabljala za presejanje populacije bolnikov, ki bi lahko imela koristi od ciljnega zdravila, vendar je za to potrebnih več podatkov. stopnja III, ciljne genske variante, ki so pokazale klinično korist pri drugih vrstah raka; stopnja IV, samo ciljne genske variante, podprte s predkliničnimi dokazi; v stopnji V obstajajo dokazi, ki podpirajo klinični pomen ciljanja mutacije, vendar zdravljenje z enim samim zdravilom proti tarči ne podaljša preživetja ali pa se lahko sprejme strategija kombiniranega zdravljenja; stopnja X, pomanjkanje klinične vrednosti.